бумажная хроматография

БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (БХ)

вид хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке растворителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографич. зон на бумаге после завершения разделения. В БХ используется гл. обр. спец. хроматографич. бумага, которая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы.

В распределительной БХ неподвижная фаза — адсорбированная бумагой вода или неполярные орг. растворители, которыми пропитывают бумагу (вариант с обращенными фазами), а элюент — соотв. смеси орг. растворителей с водой, часто содержащие также кислоты, комплексообразующие и др. вещества, или водные растворы неорг. кислот и солей. Скорость перемещения компонентов зависит от коэф. их распределения между фазами и от соотношения объемов этих фаз.

В адсорбционной БХ разделение компонентов смеси происходит благодаря различию в их сорбируемости адсорбентом — бумагой. В качестве элюента используются гл. обр. смеси орг. растворителей с водой.

В ионообменной БХ используют бумагу, пропитанную ионообменными смолами. Скорость миграции компонентов в этом случае зависит гл. обр. от констант ионного обмена и pH элюента.

Осадочная БХ осуществляется на бумаге, импрегнированной раствором реагента-осадителя, образующего с разделяемыми веществами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется произведениями растворимости этих соединений.

В лигандообменной БХ бумагу предварительно обрабатывают растворами ионов металлов, напр. Cu²⁺ при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соед. с ионами металлов.

На практике часто реализуются одновременно неск. механизмов разделения. БХ осуществляется в стеклянных хроматографич. камерах или др. закрытых сосудах. Для улучшения воспроизводимости их часто кондиционируют, покрывая внутр. стенки фильтровальной бумагой, смоченной соответствующим растворителем. В камеру помещают лоток с элюентом, в который опускают край хроматографич. бумаги после нанесения на нее пробы разделяемых веществ (обычно объемом 1–10 мкл). Элюент движется под действием капиллярных и гравитац. сил. По расположению бумаги и направлению тока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную БХ. Хроматографирование можно проводить также в центробежном поле или в условиях градиента температуры, что увеличивает эффективность и скорость разделения. В т. наз. двумерной БХ пробу наносят в один из углов квадратного листа и после завершения хроматографирования в одном элюенте бумагу высушивают и, повернув на 90°, погружают в др. элюент. На двумерной хроматограмме получают до n² хроматографич. зон, где и — число зон, образующихся при обычной (одномерной) БХ.

После подъема растворителя на определенную высоту бумагу вынимают из камеры, высушивают и выявляют хроматографич. зоны. Если зоны не окрашены, хроматограмму опрыскивают растворами специфич. реагентов, образующих с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Используют также ферментативные и биол. методы детектирования, напр., для выявления ферментов хроматограмму обрабатывают раствором соответствующих субстратов. Радиоактивные вещества обнаруживают, экспонируя хроматограмму на рентгеновскую пленку.

Положения хроматографич. зон в БХ характеризуют величиной R_f, представляющей собой отношение пути, пройденного центром хроматографич. зоны, к пути, пройденному фронтом растворителя: R_f= 1/[1 + (K_dV_s/V_m)], где K_s и V_т- объемы соотв. неподвижной и подвижной фаз, K_d-коэф. распределения вещества между этими фазами. Погрешность определения R_f ок. 5%. В стандартизованных условиях эта величина постоянна для каждого вещества и используется для его идентификации.

Количеств. анализ проводят непосредственно на хроматограммах или после отделения вещества хроматографич. зон от целлюлозной основы. В первом случае компоненты определяют с помощью сканирующей денситометрии, флуориметрии, фотометрии или по размеру хроматографич. зон, а также активац. методами (при использовании последних двух методов зоны предварительно вырезают). Пределы обнаружения веществ в зонах по окрашенным производным составляют 0,1–10 мкг, флуориметрически -10⁻³–10⁻² мкг, активационным методом — 10⁻⁴–10⁻¹⁰ мкг. Отделение компонентов от целлюлозной основы осуществляют экстрагированием, сжиганием бумаги или кипячением ее в смеси кислот. Затем компоненты определяют любым подходящим методом, обычно спектрофотометрическим, титриметрическим или кинетическим. Погрешность количеств. анализа не превышает 10%.

С помощью БХ можно разделить и анализировать практически все классы хим. соед., в т. ч. аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, БХ в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных веществ, в частности пептидов.

Достоинства БХ: возможность разделения малых количеств (0,001–1 мкг) веществ, высокая чувствительность, простота аппаратуры. Недостаток метода: сильное размывание хроматографич. зон, связанное с неоднородностью бумаги. Вследствие этого для разделения сложных смесей веществ необходимо использовать листы длиной ок. 1 м, что приводит к увеличению длительности эксперимента (для двумерной БХ до 15–20 ч) и большому расходу растворителя.

^{Лит.: Хроматография на бумаге, пер. с чеш., М., 1962; Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам, пер. с англ., т. 1, М., 1982, с. 58–151.}

_{Б. Г. Беленький}