эксклюзионная хроматография

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ситовая хроматография)

жидкостная хроматография, основанная наразл. способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, который служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент — орг. растворитель) и гель-фильтрацию (элюент — вода).

Ддя Э. х. используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для Э. х. полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а для Э. х. гидрофильных полимеров — гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для Э. х. высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы — декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.

Э. х. эффективно применяют при разработке новых полимеров, технол. процессов их получения, контроле производства и стандартизации полимеров. Э. х. используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

При Э. х. молекулы, имеющие в растворе большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэф. распределения K_d, от которого зависит объем удерживания компонента V_R в колонке:

где V₀ — объем пространства между частицами сорбента, V_p -объем пор сорбента.

Эффективным размером макромолекулы при Э. х. является ее гидродинамич. радиус R, который вместе с мол. массой полимера М определяет характеристич. вязкость полимера (уравнение 2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В — константы. Уравнение (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров. Используя уравнение Марка — Ку-на-Хувинка: и а — табулированные константы, учитывающие взаимод. полимера с растворителем и степень жесткости макромолекулы, можно перейти от универсальной зависимости (2) к рабочей зависимости (3) для исследуемого образца (рис. 2):

гдеС₂ = B(a+1).

_{Рис. 1. Универсальная калибровочная зависимость Бенуа для эксклюзионной хроматографии: — полибутадиен.}

С др. стороны, получив экспериментально зависимость (2) с использованием полимерных стандартов (не менее 3 образцов), для которых известны М, , а и константы C₁ и C₂. Можно определять зависимость (3) и непосредственно путем калибровки узкодисперсными (с известными М) и широкодисперсными (с известным ММР) стандартами. Располагая эксклюзионной хроматограммой и калибровочной зависимостью определяют ММР исследуемого полимера.

_{Рис. 2. Рабочая калибровочная зависимость для эксклюзионной хроматографии.}

В области от V₀до V_T (объем колонки, доступный для растворителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего М_мин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам V₀ и V_T мол. массы представляют собой пределы исключения — М_макс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и М_мин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Эти величины, а также тангенс угла наклона линейной части калибровочной зависимости селективности разделения С₂ = V_p/lg(M_макс/M_мин) и степень ее линейности определяют качество сорбента для Э. х. Благодаря логарифмич. зависимости V от М селективность разделения dV/dM падает с увеличением М, поскольку C₂ = (dV/dM)M. Для разделения макромолекул с близкими М требуется сорбент, работающий в узком диапазоне М и обладающий высокой селективностью C₂. Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределахМ_МАКС, образуя ложные хроматографич. пики.

Механизм Э. х. Макромолекулы в растворе представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и раствором контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из раствора в поры: , a K_d, зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1.

В критич. условиях, когда при переходе макромолекул из раствора в поры сорбента энергия Гиббса не изменяется макромолекулы с большей М сильнее вытесняются из пор, т. к. их энтропия при переходе из раствора в поры уменьшается в большей степени.

На рис. 3 показаны кривые зависимости при попадании макромолекулы в поры и, следовательно, разделение макромолекулы более селективно.

_{Рис. 3. Зависимость для разных N(N1} N>N₂N>N₃).

Гетерополимеры (сополимеры, функциональные олигомеры) можно анализировать как с помощью Э. х. (когда у всех компонентов получать с помощью Э. х. ММР олигомеров для каждого типа функциональности.

У макромолекул, несущих электрич. заряд (полиэлектролитов), наблюдаются схожие, но более сильные изменения в зависимости от pH и ионной силы элюента, Это происходит благодаря увеличению размеров молекул полиэлектролитов при их диссоциации и проявлению кулоновских взаимод. между зарядами на больших расстояниях, чем в случае действия дисперсионных или электростатич. сил. При увеличении pH выше 4 поверхность силикагелей приобретает отрицательный заряд. Взаимод. с ней нейтральной макромолекулы остается эксклюзионным (режим Э. х.), поликатион адсорбируется благодаря ионообменной сорбции, а полианион исключается из пор по законам ионной эксклюзии значительно сильнее, чем при обычной эксклюзии.

Для подавления нежелательных для Э. х. явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют поверхность сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при pH > 4), увеличивают ионную силу растворителя, ослабляя кулоновские взаимод., добавляют орг. растворители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрич. точку у полиамфолитов. С др. стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их растворов, то при Э. х. макромолекулы на краях хроматографич. колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам Э. х., а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда поверхности сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 4), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

_{Рис. 4. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в).}

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимод. макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами поверхностью сорбента или при электростатич. взаимод. поверхностных силанольных гидроксигрупп с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении Э.х.

Техника Э. х. Для разделения макромолекул в режиме Э. х. используют колонки двух типов: работающие в узком= 10⁴ — 10⁵ диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается т. обр., чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наиб. степень селективности C₂. Можно также составлять колонки для широкого диапазона М из колонок первого типа.

Разные типы полимеров требуют спец. растворителей для Э. х. наиб. универсальный растворитель — ТГФ (для Э. х. полибутадиена, полистирола, полиметакрилата, полиакрилатов). ТГФ имеет низкую вязкость, однако требует очистки от пероксидов. Толуол, хлороформ и метилэтилкетон также широко используют в Э. х. полимеров. Для Э. х. полиолефинов применяют о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол, а для полиакрилонитрила, полиэфиров и полиамидов — м-крезол, фторированные спирты и кислоты.

Калибровку колонок в диапазоне масс 5∙10²- 1,5∙10⁷ осуществляют с помощью стандартных узкодисперсных полистиролов. Выпускают также стандарты полиметилметакрилата, полиизопрена, полиэтилена, полиэтиленгликоля и биополимеров (декстран и др.).

Э. х. осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5∙10⁻⁸ ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5∙10⁻⁵ %. Обычно прибор работает при комнатной температуре, однако Э. х. полиолефинов требует повышенной температуры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Совр. хроматографы комплектуются автоматич. устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация раствора) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Концентрацию пробы (с) следует уменьшать с ростом М полимера: для полимера с М10⁴ с = 0,25 % по массе, 3∙10⁴ - 2∙10⁴ с = 0,1%, 4∙10^{5 −} 2∙10⁶ с = 0,05%, М>2∙10⁶с = 0,01%.

Применение комбинации рефрактометрич. детектора и детектора многоуглового рассеяния света — фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам.

Э. х. применяют для исследования и выделения полимеров в диапазоне М 10² — 2∙10⁷. Наилучшая селективность достигнута для олигомеров — выделяют олигомергомологи с числом звеньев до 10–15. Особенность Э. х. олигомеров состоит в том, что на хроматограмме выходят пики для каждого из олигомергомологов, присутствующих в олигомере. Поэтому можно определять ММР олигомера без калибровки колонок, если известна М одного или неск. олигомергомологов.

При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от Э. х. синтетич. полимеров и олигомеров, используемой гл. обр. в аналит. целях, гель-фильтрация белков — один из важнейших способов их выделения и очистки. Разрешение белков по М при гель-фильтрации ниже, чем при гель-проникающей хроматографии синтетич. полимеров, т. к. для белков RМ ^1/2. Можно повысить чувствительность определения М белков методом гель-фильтрации, если проводить ее в условиях денатурации: в о М растворе гуанидинхлорида (R ~ М ^1/2) или в растворе додецилсульфоната Na (R ~ M).

Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, которые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по мол. массе, в качестве сорбента они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять ММР полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.

^{Лит.: Беленький Б.Г., Виленчик Л. 3., Хроматография полимеров, М., 1978; Нефедов П. П., Лавренко П. Н., Транспортные методы в аналитической химии полимеров, Л., 1979; Энтелис С.Г., Евреинов В. В., Кузаев А. И., Реакционноспособные олигомеры, М., 1985; Yau W.W., Kirkland J., Bly D., Modern size-exclusion liquid chromatog, raphy, N.Y., 1979; Belenkii B.G., Vilenchik L.Z., Modem liquid chromatognphy of macromolecules, Amst., 1983.}

_{Б. Г. Беленький}